تکثیر سریع DNA در دمای ثابت

به گزارش ایسنا، روش‌های تکثیر اسیدهای نوکلئیک، نقش مهمی در بیولوژی مولکولی دارند. در این بین، تعدادی از تکنیک‌ها به صورت تک دمایی و بدون نیاز به سکیل حرارتی ارائه شده‌اند که علاوه بر داشتن سرعت بالا در تکثیر، به سادگی قابل انجام هستند و در تشخیص‌های مولکولی مورد استفاده قرار می‌گیرند.

وحید جاجرمی ــ کارشناس ارشد بیوتکنولوژی پزشکی ــ که این طرح در قالب پایان نامه وی انجام و ارائه شد، با بیان این مطلب افزود: تکنیک حاضر با عنوان CMA از جمله تکنیک‌هایی به شمار می‌رود که قادر است، باعث تکثیر DNA در دمای ثابت شود.

دو نوع آنزیم در این روش استفاده می‌شود پرایمرهای مورد استفاده در این روش، به صورت کایمریک می‌باشند و هر پرایمر از سه قسمت تشکیل یافته است.

در ناحیه '5 آن یک قطعه 5 ــ4 نوکلئوتیدی DNA قرار می‌گیرد. قطعه RNA به طول 5 ــ4 نوکلئوتید در وسط و نهایتا در قسمت '3 آن، قطعه‌ای از جنس DNA به طول تقریبی 20 ــ17 نوکلئوتید قرار دارد.

در اثر اتصال پرایمر به تک رشته الگو در ناحیه RNA پرایمر، یک هیبرید DNA/ RNA ایجاد می‌شود.

این هیبرید، مورد شناسایی و حمله آنزیم RNASEH قرار می‌گیرد و روی رشته RNA برشهایی ایجاد می‌کند. به این ترتیب در محل برش OH '3 آزاد ایجاد می‌شود.

آنزیم DNA پلیمراز این شکاف‌ها را مورد شناسایی قرار می‌دهد و از ناحیه شکاف شروع به فعالیت پلیمریزاسیون می‌کند .

وی در ادامه گفت: یکی از خواص آنزیم این است که در هنگام پیشروی، اگر به ناحیه دو رشته‌یی برخورد کند، رشته متصل به رشته الگو را کنار می‌زند.

با کنار زدن این رشته، یک تک رشته ایجاد می‌شود. قسمت DNA ناحیه '3 پرایمر Backward، به این تک رشته اتصال می‌یابد و توسط آنزیم DNA پلیمر از گسترش می‌یابد.

انتهای '3 رشته الگو نیز توسط آنزیم گسترش می‌یابد و ناحیه مکمل پرایمر ساخته می‌شود، بدین ترتیب یک دو رشته‌یی ایجاد می‌شود که در ناحیه ای از طول خود دارای هیبرید DNA/ RNA است و مجددا مورد حمله آنیزم RNaseH قرار می‌گیرد.

پژوهشگر دانشگاه تربیت مدرس همچنین تصریح کرد: این تکنیک قادر است در مدت کمتر از یک ساعت باعث تکثیر DNA الگو شود، دمای واکنش در محدوده بین 6 تا 65 درجه سانتیگراد است، ولی آنزیم‌ها تا دمای 7 درجه سانتیگراد را نیز تحمل می‌کنند و تا این حد از دما، تکثیر انجام پذیر است.

جاجرمی در خصوص دیگر ویژگی‌های این تکنیک، گفت: از جمله خصوصیات دیگر این تکنیک توانایی تکثیر DNA ژنومی است و میزان تکثیر با افزایش غلظت پرایمرها افزایش می‌یابد.

همچنین در این تکنیک الگوی باندها روی ژل به صورت چند باندی است که ماحصل اتصال قطعات تکثیر شده و ایجاد قطعات بزرگتر است. ما احتمال می‌دهیم این حالت در اثر پدیده Template switching آنزیم DNA پلیمراز انجام می‌شود.

گفتنی است، این پژوهش با راهنمایی دکتر مهدی فروزنده مقدم ــ عضو هیات علمی دانشگاه تربیت مدرس - انجام شده است.